Während das tödliche T-Virus sich weiter auf der Welt verbreitet und die Bevölkerung in fleischfressende Zombies verwandelt, erwacht Alice (Milla Jovovich) in der Zentrale der Umbrella Corporation. Dort lässt ihre einstige Freundin Jil Valentine (Sienna Guillory), mithilfe des Supercomputers Red Queen, in zahlreichen Simulationskammern unterschiedliche Waffen- und Systemstests durchführen. Der Weg zur Freiheit führt Alice und ihre Mitstreiter, darunter Spionin Ada Wong (Bingbing Li), einmal quer durch die mit todbringenden Monstern gespickte Zentrale. Gemeinsam kämpfen sich die neuen Verbündeten und alten Freunde durch unterirdische Großstadtsimulationen von Tokio, New York, Washington D. C. und Moskau, um einer feindseligen Welt am Rande des Zusammenbruchs zu entkommen. Der Countdown hat begonnen...